1. 单细胞样品制备 (Sample Preparation)

高质量的单细胞悬液是流式检测成功的前提。制备方法取决于样品来源：

悬浮细胞 (Suspension Cells)

如血液细胞、淋巴细胞或悬浮培养的细胞系。

• 操作：直接收集细胞于离心管 → 离心沉淀 → PBS 清洗重悬 → 调整细胞浓度 → 上样标记。

贴壁细胞 (Adherent Cells)

如上皮细胞、成纤维细胞等。

• 操作：胰酶 (Trypsin) 消化（注意控制时间，避免损伤表面抗原）→ 培养基或 PBS 吹打分散 → 收集细胞 → 离心清洗 → 上样标记。

2. 荧光标记与封闭 (Staining & Blocking)

2.1 样品封闭 (Blocking)

为了防止抗体与细胞表面的 Fc 受体发生非特异性结合（导致背景噪音过高），必须进行封闭。

• 方法：在加特异性抗体前，先加入非特异性 IgG（如正常血清或专用 Fc 封闭剂）孵育细胞。

2.2 标记方法

• 直接标记法：直接加入荧光素偶联的一抗。步骤简单，背景低，推荐使用。
• 间接标记法：先加未标记的一抗，洗涤后再加荧光素偶联的二抗。步骤繁琐，但信号放大倍数高，适用于检测低表达抗原。

3. 电压设定 (Voltage Settings)

电压调节决定了光电倍增管 (PMT) 对信号的放大倍数，直接影响数据的质量。

• 调节目标：让阴性细胞群位于坐标轴的左侧 1/4 区域内，同时保证阳性细胞群不超出坐标轴右侧边界。
• 操作原则：通常使用未染色细胞（阴性对照）来调节电压。

4. 对照设置 (Controls)

没有对照的流式实验是不可信的。常见的对照包括：

对照类型	目的与作用
空白对照	不加任何抗体。用于调节电压，确定细胞的自发荧光水平。
同型对照	使用与一抗相同种属、亚型但无特异性的抗体。用于排除抗体非特异性结合造成的假阳性。
单阳性对照	只标记一种颜色的抗体。用于调节荧光补偿 (Compensation)。
FMO 对照	"Fluorescence Minus One"（减一对照）。多色分析的金标准，用于精确划定阳性门的边界。

5. 荧光补偿调节 (Compensation)

当两种荧光素的发射光谱发生重叠时（例如 FITC 的光漏到了 PE 通道里），就需要进行补偿调节，扣除这部分干扰信号。

5.1 为什么要调节补偿？

如果不调节，单阳性细胞在双参数散点图中会呈现出倾斜的“彗星尾巴”状，导致无法正确区分双阳性细胞。

5.2 调节效果图解

图1：补偿调节效果示意（A: 未补偿/欠补偿；B: 正确补偿；C: 过补偿）

• 欠补偿：阳性群向右上方倾斜，导致假双阳性。
• 过补偿：阳性群向右下方倾斜，导致数据异常。
• 正确补偿：阳性群的中心与阴性群的中心在 Y 轴（或 X 轴）上处于同一水平/垂直线上，呈正交分布。

6. 其他关键设置

6.1 阈值 (Threshold)

用于剔除细胞碎片。通常以 FSC (前向角散射) 为触发参数，设定一个数值（如 10,000）。凡是 FSC 信号低于该值的颗粒（通常是碎片）都不会被仪器记录。

6.2 死细胞排除

死细胞会非特异性地摄取荧光抗体，产生假阳性。常用的死活染料是 7-AAD 或 PI。它们不能进入活细胞，但能染死细胞的 DNA。在分析时，圈出 7-AAD 阴性的细胞群（活细胞）进行分析。

6.3 流速控制

• 低流速 (Low)：样品流核心细，细胞排队整齐，分辨率高（CV值小），适合精细分析（如 DNA 周期分析）。
• 高流速 (High)：样品流变宽，检测速度快，但分辨率下降，适合定性分析或稀有细胞寻找。